Sonderforschungsbereich 415:
"Spezifität und Pathophysiologie von Signaltransduktionswegen"

Projekt A9: »Regulation der Expression und Signaltransduktion des CD95 Liganden auf T-Lymphozyten und Tumorzellen«

Zusammenfassung

Wiederholte Stimulation von T-Lymphozyten löst in sensitiven Zellen eine durch CD95/CD95L vermittelte Apoptose aus. Die Regulation dieses ‚aktivierungsinduzierten Zelltodes' erfolgt auf Ebene der CD95L-Oberflächenexpression. Die Signalwege nach Bindung des Liganden an den Rezeptor sind in vielen Details aufgeklärt. Im Gegensatz dazu ist die Regulation der Induktion und Stabilisierung der CD95L Expression relativ unklar. Zudem wird dem CD95L neben der Apoptose-induzierenden Interaktion mit CD95 eine entscheidende Funktion als Modulator der T-Zellaktivierung zugesprochen. Ziel des Projektes ist, die dazu erforderliche retrograde Signaltransduktion des CD95L biochemisch und funktionell zu analysieren. Die Arbeitshypothese ist, daß die reversen (retrograden) Signale im wesentlichen von Proteinen vermittelt werden, die mit dem Prolin-reichen zytoplasmatischen Anteil des CD95L assoziieren. Derartige Signalmoleküle sollten über Src Homologie 3 (SH3-) Domänen verfügen und zudem Bestandteil der Signalkaskade nach T-Zellrezeptor-Stimulation sein.

Seit Beginn der Förderung des Teilprojektes ist es gelungen, verschiedene Proteine zu identifizieren, die die genannten Kriterien erfüllen und deren als GST-Fusionsproteine exprimierte SH3-Domänen spezifisch mit dem CD95L interagieren: Src-verwandte Kinasen, Grb-2-verwandte Adapterproteine, NCF-1 (neutrophil cytosol factor 1 = p47-phox) sowie die p85-Untereinheit der PI 3-Kinase. Damit wurde das wesentliche Ziel des Erstantrages erreicht. Im Vordergrund des Fortsetzungsantrages steht zunächst die weitere Charakterisierung der Protein-Protein-Wechselwirkungen in Hinblick auf die Spezifität und Selektivität der Bindungen. Im weiteren Verlauf soll die Frage der funktionellen Bedeutung der identifizierten Signalproteine im Rahmen der Aktivierung von T-Lymphozyten-Subpopulationen beantwortet werden. Außerdem soll der Einfluß CD95L-assoziierter Signalkomplexe in Tumorzellen im Zusammenhang mit einer reduzierten Apoptoserate und im Kontext mit einem möglichen Gegenangriff gegen T-Lymphozyten untersucht werden. Die Analysen werden zudem dazu beitragen, die bislang nur unzureichend bekannten Mechanismen der Induktion und Stabilisierung der Oberflächenexpression des CD95L zu definieren.

Ziele

Das Teilprojekt untersucht die Funktion des CD95L Moleküls als Regulator von Aktivierungs- und Deaktivierungsprozessen. In den oben dargestellten Experimenten wurden verschiedene Proteine/Proteinfamilien identifiziert, die an der reversen Signaltransduktion oder der Regulation der Expression von CD95L in verschiedenen Zellen beteiligt sein können. In Hinblick auf TZR-induzierte Signalkaskaden sind insbesondere weitergehende Untersuchungen bezüglich der Assoziation von CD95L mit Src-verwandten Kinasen, der Lipid Kinase PI 3-Kinase und den Adapterproteinen der Grb-2 Familie von Interesse. Die unter den Punkten 4. und 5. aufgeführten funktionellen Untersuchen stellen die eigentlichen Ziele des Projektes dar. Die Identifizierung neuer Protein-CD95L-Wechselwirkungen soll parallel zur funktionellen Charakterisierung bereits nachgewiesener Interaktionen durchgeführt werden. Im einzelnen sollen folgende Punkte untersucht werden:

1. Charakterisierung SH3-bindender Interaktoren für CD95L in vitro

Die Vorarbeiten haben die Strategie bestätigt, die Suche nach potentiellen Interaktoren zunächst auf die Prolin-reichen Regionen des zytoplasmatischen Anteils von CD95L zu fokussieren. Die SH3-Bindung an Proteine mit bekanntermaßen zentraler Funktion auch bei der Signalleitung über verschiedene Rezeptorsysteme (TZR, Wachstumsfaktor-Rezeptoren) soll mittels Peptidkompetition unter Verwendung von CD95L Peptiden analysiert werden.

2. Identifizierung weiterer Interaktoren für CD95L in vitro

Über Expressions-Screening und ‚Interaction-Trap' soll nach weiteren Proteinen gefahndet werden, die möglicherweise auch unabhängig von SH3-Domänen mit dem zytoplasmatischen Anteil des CD95L assoziieren.

3. Charakterisierung der intrazellulären Interaktoren für CD95L in vivo

Mittels Präzipitation und anschließender 2D-Gelelektrophorese, Western Blot oder Proteinsequenzierung sollen aus CD95L-exprimierenden T-Zellklonen sowie PHA-Blasten und Tumorzellen in vivo mit CD95L interagierende Moleküle isoliert und identifiziert werden.

4. Reverse Signaltransduktion über CD95L

Die beschriebene CD95L-Assoziation verschiedener Signalproteine über SH3-Domänen eröffnet die Möglichkeit, die reverse Signaltransduktion über CD95L in Hinblick auf eine mögliche Beeinflussung der T-Zellaktivierung bzw. auch der Transformation von Tumorzellen zu untersuchen. Im Vordergrund dieser Experimente werden die CD95L-bindenden Proteine stehen, die bei der TZR/CD3-Signaltransduktion eine Rolle spielen, d.h. Src Kinasen (Fyn, Lck und Yes), Adapterproteine der Grb-2-Familie (Grb-2, Gads, Grap) und die Lipid-Kinase PI 3-Kinase. Als zelluläres System sollen CD95-resistente (entweder CD95-negative oder CD95-positive) Varianten von Jurkat eingesetzt werden, die eine zumindest in Hinblick auf die frühen Ereignisse der TZR/CD3-Stimulation eine normale Antwort zeigen. Zur Untersuchung der reversen Signale in Tumorzellen stehen verschiedene Pankreas- und Colonkarzinom-Linien zur Verfügung. Wir wären des weiteren daran interessiert, Veränderungen der Genexpression nach Stimulation über CD95L und/oder Co-Stimulation über den TZR/CD3-Komplex mit Hilfe der Array- Technologie zu analysieren. Dabei sind insbesondere Faktoren von Interesse, die mit Zytokinproduktion, Zellzyklus-Progression und Apoptose/Antiapoptose zu korrelieren sind.

5. Regulation der Expression von CD95L in T-Zellen und in Tumorzellen

Die Regulation der aktivierungsinduzierten CD95L mRNA- und Oberflächenexpression wird ebenfalls in verschiedenen T-Zellpopulationen und Tumorzellen in Hinblick auf eine mögliche Beteiligung der identifizierten Interaktoren zu klären sein. Die Expression von CD95L auf verschiedenen Tumoren soll dabei im Zusammenhang mit einer möglichen Eliminierung aktivierter (CD95-positiver) T-Zellen und in Hinblick auf eine mögliche Beeinflussung der Wachstumskontrolle untersucht werden.

Projektrelevante eigene Veröffentlichungen

Kreuz, S., Siegmund, D., Rumpf, J.-J., Samel, D., Leverkus, M., Janssen, O., Hacker, G., Dittrich-Breiholz, O., Kracht, M., Scheurich, P., Wajant, H. (2004) NFkB activation by Fas is mediated through FADD, Caspase-8 and RIP and is inhibited by FLIP.

EMBO J. submitted

Oberg, H.H., Sipos, B., Kalthoff, H., Janssen, O., Kabelitz, D. (2004) Expression of the human TDAG51 gene is regulated by MAP kinase via PKC and/or Ras and does not correlate with AICD.

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Cell Death Differ, submitted

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Wenzel, J., Sanzenbacher, R., Ghadimi, M., Lewitzky, M., Zhou, Q., Kaplan, D., Kabelitz, D., Feller, S.M., Janssen, O. (2001) Multiple interactions of the cytosolic polyproline region of the CD95 ligand: hints for the reverse signal transduction capacity of a death factor.

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Reviews

Janssen, O., Qian, J., Linkermann, A., Kabelitz, D. (2003) CD95 ligand - death factor and costimulatory molecule?

Cell Death Diff,. 10, 1215-1225

Linkermann, A., Qian, J., Janssen, O. (2003) Slowly getting a clue on CD95L biology.

Biochem Pharmacol. 66, 1417-1426

Linkermann, A., Qian, J., Kabelitz, D., Janssen, O. (2003) FasL as a death regulator and signal transducer.

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Weitere Publikationen

Linkermann, A., Qian, J., Janssen, O. (2004) FasL retrograde signalling.

in: Wajant H (Ed.) Fas signalling. Landes Bioscience, in press