Sonderforschungsbereich 415:
"Spezifität und Pathophysiologie von Signaltransduktionswegen"

Projekt A9: »Regulation der Expression und Signaltransduktion des CD95 Liganden auf T-Lymphozyten und Tumorzellen«

Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) spielt als Todesfaktor eine zentrale Rolle bei der Induktion von Apoptose im Immunsystem. CD95L ist an der Beendigung einer Immunantwort im Rahmen des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) beteiligt, ist Effektormolekül zytotoxischer T-Zellen und Natürlicher Killerzellen und zeichnet für die Ausbildung von immunprivilegierten Geweben mitverantwortlich. Auf Tumoren exprimiert, schützt CD95L diese vor Angriffen CD95-positiver Tumor-infiltrierender Lymphozyten. CD95L reguliert als kostimulatorisches Molekül die Aktivierung von peripheren T-Zellen und als akzessorisches Molekül die (positive) Selektion von Thymozyten. CD95L tritt als membranständiger Rezeptor oder löslicher Faktor auf. Erhöhte Serumlevel von CD95L werden mit der Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen assoziiert, wobei nur in wenigen Fällen eine Korrelationen der CD95L-Level mit Krankheitsstadien oder -progression nachgewiesen werden konnte.

CD95L wird in zytotoxischen Zellen in sekretorischen Lysosomen gespeichert und nach Stimulation mit deren anderen Komponenten in die immunologische Synapse entlassen. Beim AICD CD4-positiver T-Zellen wird CD95L neu synthetisiert und schnell und transient auf der Zelloberfläche exprimiert. Bisher ist weitgehend unklar, wie die verschiedenen Expressionsmuster und Funktionen des CD95L molekular und biochemisch reguliert sind.

In der vergangenen Förderperiode haben wir zunächst eine Reihe von Proteinen identifiziert, die an der Regulation der Expression und reversen Signaltransduktion des CD95L beteiligt sein könnten. Zahlreiche isolierte SH3- und WW-Domänen interagieren in vitro mit der zytoplasmatischen, prolinreichen Domäne des CD95L. Die Assoziation ist selektiv und lässt sich durch bestimmte CD95L-Peptide blockieren. Viele der getesteten CD95L-bindenden Proteine sind Enzyme und Adapterproteine, denen entscheidende Funktionen im Rahmen der TZR/CD3-vermittelten Signaltransduktion zukommen.

In dieser Förderperiode soll die wechselseitige Beeinflussung der TZR- und CD95L-Signalkaskaden analysiert werden, die sich in einer reduzierten Proliferation und Tyrosin-phosphorylierung nach Vorstimulation mit FasFc-Fusionsproteinen und anti-CD95L Antikörpern manifestiert. Basierend auf Hinweisen aus der Literatur und auf eigenen Vorbefunden wird auch die Rolle von Casein Kinasen bei der Regulation der retrograden Signalübermittlung untersucht werden.

Der zytoplasmatische Anteil des CD95L präzipitiert aus T-Zelllysaten unter anderem PACSIN2 und FBP17. Beide Proteine stehen mit dem Zytoskelett-vermittelten Lysosomen-Transport in Verbindung. Co-Transfektionen und Co-Präzipitationen mit CD95L bestätigen die Assoziation und zeigen, dass diese Proteine im Wildtyp (nicht aber als SH3 Mutanten) in der Lage sind, die intrazelluläre Verteilung des CD95L zu verändern. In Zukunft soll die Bedeutung von FBP17 und PACSIN2 sowie anderer Proteine dieser Familie für das lysosomale Targeting und den Transport des CD95L in T-Zellen und Tumorzellen im Detail untersucht werden.

Zwei der drei SH3-Domänen des Adapterpoteins Nck binden CD95L in vitro. Nck spielt in T-Zellen eine Rolle bei den Veränderungen des Zytoskeletts im Rahmen der Ausbildung der immunologischen Synapse. Mittels Co-Transfektion und Co-Präzipitation lässt sich auch diese Interaktion bestätigen. Weitere Analysen mittels konfokaler Mikroskopie weisen darauf hin, dass Nck nach Stimulation (z.B. durch Phorbolester und Ionophor) zusammen mit CD95L und Cathepsin D als lysosomalem Marker transloziert. In dieser Förderperiode sollen Unterschiede in der Induzierbarkeit dieser Translokation (u.a. in die Kontaktzone zwischen T-Zelle und Zielzelle) in verschiedenen Zellpopulationen untersucht werden.

Die Beobachtung, dass der CD95L in verschiedenen Langzeit-Klonen eine biphasische Expressionskinetik zeigt (1. Maximum nach 10 Minuten, 2. Maximum nach 120-150 Min.) deutet auf eine Freisetzung (Shedding) oder Internalisierung des Moleküls hin. Welche der beiden Möglichkeiten zutrifft, soll in Kooperation mit am SFB beteiligten Arbeitsgruppen geklärt werden.

Projektrelevante eigene Veröffentlichungen

Lettau M, Pieper J, Gerneth A, Lengl-Janßen B, Voss M, Linkermann A, Schmidt H, Gelhaus C, Leippe M, Kabelitz D, Janssen O. (2010) The adapter protein Nck: Role of individual SH3 and SH2 binding modules for protein interactions in T lymphocytes.

Protein Science 19: 658-669

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Paulsen M, Valentin S, Mathew B, Adam-Klages S, Bertsch U, Lavrik I, Krammer PH, Kabelitz D, Janssen O. (2010) Modulation of CD4+ T cell activation by CD95 costimulation.

Cell Death Differ, in revision

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Cell Commun Signal 7:1

Lettau M, Paulsen M, Kabelitz D, Janssen O. (2009) FasL expression and reverse signalling.

Results Probl Cell Diff 49:49-61

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Linkermann A, Gelhaus G, Lettau M, Qian J, Kabelitz D, Janssen O. (2009) Identification of interaction partners for individual SH3 domains of members of Fas ligand associated members of the PCH protein family in T lymphocytes.

Biochim Biophys Acta 1794:168-176

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J Biol Chem 284:32635-32641

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Int Immunol 21:587-598

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Lettau M, Paulsen M, Kabelitz D, Janssen O. (2008) Storage, expression and function of fas ligand, the key death factor of immune cells.

Curr Med Chem 15:1684-1696,

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Proteomics 8:2911-2925

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Br J Cancer 96:73-81

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Cell Death Differ 14:1040-9

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Br J Cancer, in press

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Weitere Publikationen

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in: Wajant H (Ed.) Fas signalling. Landes Bioscience pp97-102