Sonderforschungsbereich 415:
"Spezifität und Pathophysiologie von Signaltransduktionswegen"

Projekt B9: »Untersuchungen zur Funktion der Metalloprotease ADAM-10«

Zusammenfassung

Aktuelle Untersuchungen zeigen für eine zunehmende Anzahl sezernierter Proteine, dass diese durch Abspaltung (Shedding) von bestimmten Plasmamembranproteasen (Sekretasen) freigesetzt werden und in löslicher Form eine wichtige Funktion bei Signaltransduktionsprozessen (parakrine, juxtakrine und autokrine Signale) ausüben. In eigenen Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass die gezielte Ausschaltung, der bei diesen Prozessen beteiligten Metalloproteinase ADAM-10 in der Maus zur frühzeitigen Lethalität der Tiere am Embryonaltag E 9,5 und einem der Notch-1 Knockout-Maus ähnlichen Phänotyp führt. Die Embryonen zeigen bereits in diesem Entwicklungstadium eine Reihe phänotypischer Auffälligkeiten, die unter anderem durch pathologische Veränderungen des Zentralen Nervensystems, der Somitenbildung und des cardiovaskulären Systems gekennzeichnet sind. Unsere Untersuchungen zur möglichen Beteiligung von ADAM-10 als a-Sekretase bei der Spaltung des amyloiden Vorläuferproteins (APP) lieferten ein sehr heterogenes Bild mit einer weitgehend unveränderten APP Prozessierung in den defizienten Mauszellen.

Ein Schwerpunkt dieses Projektes stellt die Identifizierung potentieller ADAM-10 Substrate dar. Für diese Analyse stehen ADAM-10 defiziente Fibroblasten- bzw. ES-Zelllinien zur Verfügung. Diese sollen im Vergleich zu Wildtypzellen in An- bzw. Abwesenheit von Effektoren (z.B. PMA, Cyclodextrin) und Inhibitoren (z.B. TIMPs, RNAi) auf das Vorhandensein spezifischer intra- und extrazellulärer Spaltprodukte analysiert werden. Hierbei ist u.a. die Untersuchung verschiedener Transmembranproteine der EGF- und TNF-Familie von großem Interesse. Die Analyse von Membranproteinen und Proteinen im Überstand kultivierter Fibroblasten soll uns Hinweise auf mögliche endogene ADAM-10 Substrate liefern. In einem weiteren Teilprojekt soll die Regulation der proteolytischen Aktivität von ADAM-10 untersucht werden. Hierzu sollen unterschiedliche Proteindomänen von ADAM-10 mit der strukturell verwandten Protease ADAM-17 (TNFa-converting enzyme, TACE) ausgetauscht und die Aktivität der chimären Proteasen an ADAM-10 bzw. ADAM-17 spezifischen Substraten untersucht werden. In Kollaborationsprojekten wollen wir eine konditionelle Knockout-Mausmutante für ADAM-10 und ADAM-Mehrfachmausmutanten generieren. Mit Hilfe dieser Mausmodelle soll die Funktion von ADAM-10 in Neuronen und die funktionelle Überlappung der wichtigsten ADAM-Proteasen untersucht werden.

Ziele

Ausgangspunkt für unsere Untersuchungen ist das ADAM-10 defiziente Mausmodell und die Ergebnisse der bisherigen Untersuchungen zur Rolle von ADAM-10 bei der APP und Notch Prozessierung. Ziel dieses Projektes ist es, mit Hilfe ADAM-10 defizienter Embryonen und daraus abgeleiteter Zelllinien weitere Aufschlüsse über die in vivo Funktionen dieser wichtigen Metalloprotease zu erhalten. Zunächst soll untersucht werden, welche weiteren Substrate von ADAM-10 gespalten werden. Durch Generierung und Analyse von ADAM-10-Mehrfachknockoutmutanten soll die beobachtete Redundanz zwischen verschiedenen ADAM-Metalloproteinasen untersucht werden. Darüber hinaus soll die Frage geklärt werden, welche Faktoren für die Regulation der Protease-Aktivität von Bedeutung sind. In diesem Zusammenhang soll untersucht werden, welche funktionelle Relevanz die Domänenstruktur von ADAM-10 im Vergleich zum strukturverwandten ADAM-17 (TACE) darstellt. Längerfristig ist die Entwicklung einer konditionalen ADAM-10 defizienten Maus geplant, um die essentielle Bedeutung von ADAM-10 auch im adulten Organismus und in verschiedenen Geweben, z.B. dem Zentralen Nervensystem, analysieren zu können.

Ziele der geplanten Arbeiten zur Metalloprotease ADAM-10 sind

• die Identifizierung putativer Substrate
• die funktionelle Strukturanalyse zum Verständnis der Regulation der Aktivität
• Generierung und Analyse von Mehrfachkockout-Mäusen für weitere ADAM Proteasen
• Herstellung und Untersuchung einer konditionellen ADAM-10 knockout Maus

Projektrelevante eigene Veröffentlichungen

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