Sonderforschungsbereich 415:
"Spezifität und Pathophysiologie von Signaltransduktionswegen"

Projekt Z1: »Systematische Expressionsanalyse«

Veränderungen auf zellulärer Ebene, wie zum Beispiel eine Entzündungsreaktion, lassen sich sehr gut anhand der Genexpression beobachten und beschreiben. Das Muster der exprimierten Gene in einer Zelle kann wichtige Informationen über den aktuellen Zustand dieser Zelle liefern.

Die Technologie der Microarrays bietet die Möglichkeit, eine Vielzahl von Genen aus einer Gewebeprobe gleichzeitig auf ihre Expression hin zu untersuchen.

Im ersten Schritt der Expressionsanalyse werden DNA-Stränge bekannter Sequenz auf einer Glasoberfläche, auf Nylon oder einem anderen Trägermaterial immobilisert. Im nächsten Schritt werden gereinigte mRNA-Proben aus den zu untersuchenden Zellpopulationen revers transkribiert und dabei mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Radionukleotiden markiert. Der letzte Schritt wird als Hybridisierung bezeichnet: Die markierte Probe wird auf den Microarray aufgebracht. cDNA-Stränge aus der zu untersuchenden Probe binden dabei an komplementäre DNA-Stränge auf dem Array. Die resultierende Signalstärke auf einer bestimmten Position des Arrays gibt Auskunft darüber, wie stark das entsprechende Gen in der Ausgangsprobe abgelesen wurde.

Die Oberfläche von glasbasierten Microarrays zeigt eine sehr geringe Eigenfluoreszenz, was den Einsatz von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht. Mit diesem System können dann zwei zu vergleichende Proben parallel auf einem Microarray hybridisiert werden.

Neueste bioinformatische Erkenntnisse aus unserer Arbeitsgruppe weisen darauf hin, das Daten, die aus systematischen Expressionsanalysen gewonnen werden, einer Vielzahl systematischer Schwankungen unterliegen, die bislang weitestgehend nicht berücksichtigt wurden. Eine Konsequenz hieraus ist, dass Gene die mittels Microarrays als differentiell exprimiert identifiziert wurden, grundsätzlich eine Verifikation durch eine alternative Methode wie Real-Time-PCR erfordern.

Um ein möglichst angepasstes Spektrum an Microarrays innerhalb des SFB 415 zur Verfügung stellen zu können, wurden von den SFB-Mitgliedern Genlisten zu den projektspezifischen Interessensgebieten zusammengestellt. Die daraus resultierenden Genzusammenstellungen wurden in 4 themenbezogene Microarrays aufgeteilt:

1. Apoptose (408 Gene)
2. Differenzierung und Regeneration (526 Gene)
3. Entzündung und Infektion (418 Gene)
4. Maus (403 Gene)

Neben Qualitätskontrolle, Qualitätserhalt und experimentellen Durchführung der systematischen Expressionsanalyse wurden vom Z1-Projekt auch der größte Teil der bioinformatischen Auswertung der Microarraydaten übernommen. Hierzu mussten neue, auf die Anwendung der themenspezifischen Microarrays angepasste Normalisierungmethoden entwickelt werden. In Zusammenarbeit des Z1-Projektes mit der durch das Nationale Genomforschungsnetz etablierten Bioinformatikgruppe an der Klinik für Allgemeine Innere Medizin konnte als Ergebnis dieser Entwicklung eine neue, nichtlineare Normalisierungsmethode vorgestellt werden, die für themenspezifische Microarrays anwendbar ist. Der Einsatz dieser angepassten Normalisierungsmethode in Zusammenhang mit externen Kontrollen gehört neben den Arrays zu den wesentlichen Neuentwicklungen des Z1-Projektes. Eine weitere maßgebliche Neuentwicklung ist die Anwendung einer mathematischen Qualitätskontrolle, die systematische Effekte aufdecken kann, und für alle bekannten Array-Typen verwendet werden könnte.

Einen zusätzlichen Schwerpunkt stellt die beratende Funktion des Z1 Projektes in Fragen des experimentellen Setup dar, um eine spätere bioinformatische und statistische Auswertung der Ergebnisse vorzubereiten.

1. Die in der vergangenen Förderperiode durchgeführten systematischen Expressionsanalysen in Zusammenarbeit mit den Teilprojekten A2, A3, A10, A14 (jetzt A15), B2 und C8 sollen weitergeführt werden. Einen besonderen Schwerpunkt stellt hierbei die Überprüfung der identifizierten Expressionsmuster mittels größerer Probenzahlen dar.
2. Die Teilprojekte A4, A11, A12, A13, B5, B6, B8, B9, C6 und C7 sollen planmässig in der nächsten Förderperiode erstmals die Einrichtung der systematischen Expressionsanalyse nutzen. Die hierfür notwendigen Vorarbeiten wurden vom Z1-Projekt erfolgreich abgeschlossen.
3. Neben dem Einsatz der vom SFB 415 mitentwickelten, oben genannten Microarrays sollen in der kommenden Förderperiode kommerzielle Arrays mit erweiterten Genzusammenstellungen und alternativen Oberflächentechnologien genutzt werden (z.B. whole-genome Arrays).
4. Grundsätzlich müssen Ergebnisse aus Microarrayanalysen mit alternativen Methoden verifiziert werden. Die höchste Akzeptanz erfährt in diesem Zusammenhang die Technologie der Real-Time-PCR. Es ist geplant, die vom Z1-Projekt etablierte Real-Time-Technologie für die Kooperationen mit den Teilprojekten einzusetzen.

Projektrelevante eigene Veröffentlichungen

Chalaris A, Adam N, Sina C, Rosenstiel P, Lehmann J, Schirmacher P, Hartmann D, Cichy J, Gavrilova O, Schreiber S, Jostock T, Matthews V, Häsler R, Becker C, Neurath MF, Reiß K, Saftig P, Scheller J, Rose-John S. (2010) Critical Role of the Disintegrin Metalloprotease ADAM17 for Intestinal Inflammation and Regeneration in Mice.

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Franke A, Balschun T, Sina C, Ellinghaus D, Häsler R, Mayr G, Albrecht M, Wittig M, Buchert E, Nikolaus S, Gieger C, Wichmann HE, Sventoraityte J, Kupcinskas L, Onnie CM, Gazouli M, Anagnou NP, Strachan D, McArdle WL, Mathew CG, Rutgeerts P, Vermeire S, Vatn MH and the IBSEN study group, Krawczak M, Rosenstiel P, Karlsen TH, Schreiber S. (2010) Genome-wide association study for ulcerative colitis demonstrates novel associations with IL17REL and 7q22.

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Kuenzel S, Till A, Winkler M, Haesler R, Lipinski S, Jung S, Grötzinger J, Fickenscher H, Schreiber S, Rosenstiel P. (2010) The nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor NLRC5 is involved in IFN-dependent antiviral immune responses.

J Immunol 184:1990-2000

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Herrmann J, Rubin D, Häsler R, Helwig U, Pfeuffer M, Auinger A, Laue C, Winkler P, Bell D, Schreiber S, Schrezenmeir J. (2009) Isomer-specific effects of CLA on gene expression in human adipose tissue depending on PPARgamma2 P12A polymorphism.

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Sina C, Gavrilova O, Förster M, Till, A, Derer S, Hildebrand F, Rabe B, Scheller J, Chalaris A, Scheller J, Rehmann A, Franke A, Ott S, Häsler R, Nikolaus S, Fölsch UR, Rose-John S, Jiang H-P, Li J, Schreiber S, Rosenstiel P. (2009) G-protein coupled receptor 43 (GPR43) is essential for neutrophil recruitment during intestinal inflammation.

J Immunol 183:7514-7522

Sina C, Gavrilova O, Foerster M, Till A, Derer S, Hildebrand F, Raabe B, Chalaris A, Scheller J, Rehmann A, Franke A, Ott S, Haesler R, Nikolaus S, Folsch UR, Rose-John S, Jiang HP, Li J, Schreiber S, Rosenstiel P. (2009) G protein-coupled receptor 43 is essential for neutrophil recruitment during intestinal inflammation.

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Ufer M, Häsler R, Jacobs G, Haenisch S, Lächelt S, Faltraco F, Sina C, Rosenstiel P, Nikolaus S, Schreiber S, Cascorbi I. (2009) Decreased sigmoidal ABCB1 (P-glycoprotein) expression in ulcerative colitis is associated with disease activity.

Pharmacogenomics 10:1941-53

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Ufer M, Mosyagin I, Muhle H, Jacobsen T, Haenisch S, Häsler R, Faltraco F, Remmler C, von Spiczak S, Kroemer HK, Runge U, Boor R, Stephani U, Cascorbi I. (2009) Non-response to antiepileptic pharmacotherapy is associated with the ABCC2 -24C>T polymorphism in young and adult patients with epilepsy.

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Rosenstiel P, Derer S, Till A, Häsler R, Eberstein H, Bewig B, Nikolaus S, Nebel A, Schreiber S. (2008) Systematic expression profiling of innate immune genes defines a complex pattern of immunosenescence in peripheral and intestinal leukocytes.

Genes Immun 9:103-114

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Genes Immun 9: 240-248

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Sebens Müerköster S, Lust E, Arlt A, Witt M, Häsler R, Sebens T, Schreiber S, Fölsch UR, Schäfer H. (2006) Acquired chemoresistance in pancreatic carcinoma cells - Induced secretion of IL1ß and NO lead to inactivation of caspases

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Valentonyte R, Hampe J, Huse K, Rosenstiel P, Albrecht M, Stenzel A, Nagy M, Gaede KI, Franke A, Haesler R, Koch A, Lengauer T, Seegert D, Reiling N, Ehlers S, Schwinger E, Platzer M, Krawczak M, Muller-Quernheim J, Schurmann M, Schreiber S. (2005) Sarcoidosis is associated with a truncating splice site mutation in BTNL2

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Weichart D, Gobom J, Klopfleisch S, Häsler R, Gustavsson N, Billmann S, Lehrach H, Seegert D, Schreiber S, Rosenstiel P. (2005) Analysis of NOD2-mediated proteome response to muramyl-dipeptide in HEK293 cells.

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